Садржај
Генска плава ћелија је кодирана унутар свог генетског материјала, или ДНК. Како ДНК никада не напушта језгро ћелије, како би ове информације доспеле у цитоплазму у којој бораве други протеини и биохемијске компоненте, неопходно је прво превести ДНК у мессенгер РНА (мРНА или поли (А) РНА). Ова мРНА се затим преводи у протеине који обављају многе функције ћелије. Да би се откриле или квантификовале веома ретке мРНА, направиле сонде за микроарке или конструисале библиотеке комплементарних молекула ДНК, мРНА мора да буде изолована. Међутим, укупна екстракција РНА (тј. Сва РНА у ћелији) и накнадна изолација мРНА нису међусобно искључиви процеси; прва се мора извести како би се мРНА извадила.
Изолација мРНА из укупне РНА
ТРИзол хомогенизација: Укупна РНА укључује сву мРНА, трансфер РНА, рибосомалну РНК и остале некодирајуће РНА. Да бисте их одвојили од осталих ћелијских компоненти, ћелија се прво отвара и отпушта свој садржај. Ово се врши ресуспендирањем ћелија пелетираних центрифугирањем (центрифугирањем великим брзинама) у ТРИзол реагенсу (Лифе Тецхнологиес). И друге верзије ТРИзола (попут Амбионовог ТРИ реагенса) функционишу слично.
Тотална изолација РНА: Серија центрифугирања се користи за одвајање различитих компоненти (протеина, ДНК, РНА) ћелије у слојеве или фазе, унутар суспензије. Горња фаза жуте боје састоји се од масти и може се одбацити. Жељена фаза је обојена црвено, садржи укупну РНК и задржава се. После извођења екстракције фенол-хлороформа и низа испирања алкохолом коришћењем изопропанола и етанола, РНА се може гранулисати ради изолације мРНА. Додајте РНасе инхибиторе да спречите овај ензим да разгради укупну РНА.
Екстракција мРНА: Уобичајена је употреба комплета за изоловање мРНА, јер домаћи лабораторијски протоколи не стварају велике количине високо пречишћених мРНА. Комерцијални сетови укључују ФастТрацк 2.0 или Инвитроген-ов поли (А) чисти мРНА изолациони комплет. Ови основни кораци су заједнички за такве комплете:
а) Мешајте РНасе-инхибирани пуфер за лизу који се налази у комплету са до 300 микролитара укупне РНА.
б) Загревајте 5 минута на 65 степени Целзијуса, а затим одмах охладите узорак на леду током једног минута.
ц) Помешајте ово са 0,5М натријум хлорида и затим потпуно растворите Олиго дТ (олигодеокситимидилну киселину) у овом узорку.
д) Центрифугирајте овај узорак и повратите супернатант, који се испере неколико пута у низу везива и пуфера са мало соли добијених у сетовима.
е) Елуирајте мРНА неколико пута док се не добије запремина одређена китом (нпр. 500 микролитара).
ф) Талог елуата преципитацијом натријум ацетата и етанолом. Поново суспендовати у до 20 микролитара воде третиране диетилпирокарбонатом (ДЕПЦ).
г) Чувати на -80 степени Целзијуса и проверити квалитет и количину спектрофотометријом.