Садржај
- Електрофореза има ограничену анализу узорака
- Мерења електрофорезе нису тачна
- Потребан је значајан почетни узорак
- Видети се могу само поједини молекули
- Електрофореза је мала пропусност
Гел електрофореза је техника где се биолошки молекули одвајају један од другог и идентификују у биолошком истраживању или медицинској дијагностици. Од свог развоја 1970-их, ове технике су непроцењиве у идентификацији гена (ДНК) и генских производа (РНА и протеина) од истраживачког интереса. Последњих година појавиле су се новије технике које дају већу специфичност и детаље о ономе што се дешава у живим системима. Иако ове технике нису избациле електрофорезу, а напредне манипулације могу проширити одрживост технике, важно је схватити шта електрофореза гела може, а шта не може да учини.
Електрофореза има ограничену анализу узорака
Електрофореза је специфична за ткиво које сте узели из узорка. На пример, ако покренете јужну мрљу (врста електрофорезе) на јагодицама, гледате гене из епителних ћелија на вашем образу и нигде другде у телу. То понекад може бити од користи, али истраживачи су често заинтересовани за шире ефекте.
Технике као што је ин ситу хибридизација (ИСХ) могу узети део ткива и анализирати експресију гена на свакој малој површини тог узорка.Дакле, истраживачи могу сагледати свако подручје мозга у узорку са ИСХ-ом, док технике електрофорезе могу сагледати само неколико подручја одједном.
Мерења електрофорезе нису тачна
Гел електрофореза може ефикасно одвојити сличне протеине различите тежине (ово је техника која се назива Вестерн блоттинг). Прецизније их може раздвојити техником познатом као 2д електрофореза; ово је уобичајено код протеомике.
Нажалост, сва мерења извршена овом техником су у најбољем случају полуквантитативна. Да би се добила тачна маса (тежина) протеина, након примене електрофорезе пречишћеним протеинима мора се применити масена спектроскопија. Поред тога, поређење релативних количина различитих молекула зависи од густине опсега (таме) различитих флека на гелу. Ова метода има одређени степен грешке, а узорци се обично изводе више пута како би се добили чисти резултати.
Потребан је значајан почетни узорак
Електрофореза је техника изолације и визуелне идентификације различитих биомолекула. То се постиже тако да се кроз гел проведе електрична струја за одвајање набијених молекула различите тежине. Ако је молекул који вас занима није довољно уобичајен, његов опсег ће бити практично невидљив и тешко га је измерити.
ДНК и РНК се могу донекле појачати пре него што се покрене електрофореза, али то није практично да се ради са протеинима. Због тога је потребан велики узорак ткива за покретање ових испитивања. Ово може ограничити корисност технике, посебно у медицинској анализи. Практично је немогуће покренути електрофорезу на узорцима из једне ћелије; проточна цитометрија и имунохистохемија се чешће користе за процењивање протеина ћелија по ћелија. Техника звана ПЦР одлична је за прецизно мерење ситних количина РНА.
Видети се могу само поједини молекули
Електрофореза је одлична за одвајање и идентификацију биомолекула средње величине до велике величине. Међутим, многи молекули које истраживачи желе да погледају су мањи; мали хормони, неуротрансмитери и јони се не могу мерити електрофорезом. То је из два разлога: они не реагују правилно с препаратом за електрофорезу (обично техником која се зове СДС ПАГЕ) и, чак и да јесу, премали су да би се правилно одвојили и истицали би дно гела. Уместо тога, ови молекули се мере техникама као што су РИАА (радио-имуно-тестови) и ЕЛИСА-е (испитивање имуносорбантима повезаних са ензимом).
Електрофореза је мала пропусност
Гел електрофореза је генерално ниска пропусност, што значи да не даје податке посебно брзо. Контрастна електрофореза, где можете сагледати мали број РНА молекула одједном, са ПЦР (ланчана реакција полимеразе), која може истовремено да процени хиљаде узорака. Слично томе, проточна цитометрија може мерити хиљаде појединачних ћелија и правити сложене корелације, док електрофореза масовно посматра ћелије и не може да врши такве фине разлике. ПЦР и проточна цитометрија представљају огромне паралелне и серијске процесе, и оба далеко превазилазе могућности електрофорезе за генерисање података о истраживању.