Садржај
Боја по Граму је различита процедура бојења која показује које су бактерије грам-позитивне или грам-негативне на основу њихове боје. Ацетон алкохол је један реагенс који се користи у овом процесу да се омогући диференцијација боје. Грам-позитивне бактерије имају густ пептидогликански слој и љубичасто љубичасте боје, док грам-негативни микроорганизми имају мало премало пептидогликана и обоје ружичасто.
Примарна мрља-кристална љубичица
Једном када се припреми слајд узорака бактерија, кристална љубичица се користи да се узорак прво обоји. У овом тренутку ће се и грам-позитивне и грам-негативне бактерије појавити љубичасте боје. Обично се кристална љубичица нанесе на клизач 30 секунди пре него што се водом испере сувишна мрља. Кристална љубичица може се мало прилепити на слојеве пептидогликана, тако да се неће сва примарна мрља испрати водом.
Мордант-Јод
Затим се јод додаје у узорак током једног минута. Делује као мордант, који служи за фиксирање боја у процесу бојења. Јод ову функцију везује за кристалну љубичицу и ствара нерастворљиви комплекс који се много боље пријања за густи слој пептидогликана који се налази у грам-позитивним бактеријским ћелијама него само кристално љубичаста. Не следи корак прања водом након додавања јода.
Деколоризатор-алкохол
Као средство за уклањање боје може се користити ацетон или етил алкохол. Алкохол раствара липиде који се налазе у спољној ћелијској мембрани грам-негативних бактерија, омогућавајући кристално љубичасто-јодном комплексу да исцури из тањих пептидогликанских слојева. Алкохол се додаје 10 до 20 секунди; сипа се по клизишту све док се сав јод не испере и одвод се безбојно. У овом тренутку у процесу бојења по Граму, грам-негативне бактерије су безбојне, док грам-позитивне бактерије и даље задржавају кристално љубичасту боју. Након завршетка клизача потребно је испрати водом да би се зауставио ефекат уклањања боје.
Цоунтерстаин-Сафранин
Затим се додаје сафранин да би се повећала видљивост и супротност безбојним грам-негативним бактеријама. Мрља чини да ове бактерије изгледају ружичасто под микроскопом. Пошто је мрља додата целом узорку, такође мрља грам-позитивне бактерије, али тамнија од кристалне љубичице скрива светлију ружичасту боју сафранина. Након што се узорак клизава поплави сафранином око минут, вода се користи за испирање сувишних мрља које се нису пријавиле за бактеријске ћелије.