Садржај
Полимерна ланчана реакција или ПЦР је техника која фотокопира један фрагмент ДНК у многе фрагменте - експоненцијално много. Први корак је у ПЦР-у загревање ДНК тако да се денатурише или топи у појединачне нити. Структура ДНК је попут мердевина конопа у којима су решетке ужади са магнетним крајевима. Магнети се спајају у формирање трака, званих пара базе, и тако одолевају раздвајању. Сваки фрагмент ДНК се топи у појединачне нити на различитим температурама. Разумевање начина на који се структура ДНК-а спаја по појединим деловима ДНК-а ће дати увид у то зашто се различити фрагменти ДНК топе на различитим температурама и зашто су такве високе температуре потребне у првом реду.
Таљење! Таљење!
Први корак ПЦР-а је истопити ДНК тако да се дволанчана ДНК раздвоји на једноланчану ДНК. За ДНК сисара овај први корак обично укључује топлоту од око 95 степени Целзијуса (око 200 Фаренхита). На овој температури водоничне везе између парова базе А-Т и Г-Ц или стуба у лествици ДНК се раздвајају, откопчавајући дволанчане ДНК. Међутим, температура није довољно врућа да би сломила краљежницу фосфата и шећера која формира поједине жице или стубове мердевина. Потпуно одвајање појединачних ланаца их припрема за други корак ПЦР-а, који се хлади како би се омогућило да кратки фрагменти ДНК, названи прајмери, вежу појединачне нити.
Магнетни патентни затварачи
Један од разлога зашто се ДНК загрева на високу температуру од 95 степени Целзијуса је тај што је дуже што је двоструки ланац ДНК, више жели да остане заједно. Дужина ДНК је један од фактора који утиче на тачку топљења изабрану за ПЦР на том комаду ДНК. Парови А-Т и Г-Ц у дволанчаној ДНК вези међусобно држе двочлану структуру заједно. Што се више узастопних парова база између два једнострука ланца веже, то се више и њихови суседи желе везати, а јача привлачност између две нити. То је попут патентног затварача направљеног од малих магнета. Док затвараш патент затварач, магнети ће природно желети да затварају и остају затворен.
Јачи магнети залепљују се чвршће
Други фактор који утиче на температуру топљења коју треба изабрати за ваш ДНК фрагмент који вас занима је количина Г-Ц база пара присутних у том фрагменту. Сваки пар пара је попут два мини-магнета који привлаче. Пар направљен од Г и Ц је много јаче привлачен од А и Т пара. Тако ће комаду ДНК који има више Г-Ц парова од другог фрагмента бити потребна виша температура пре топљења у појединачне нити. ДНК природно апсорбује ултраљубичасту светлост - тачно на таласној дужини од 260 нанометара - а једноланчана ДНК апсорбује више светлости него дволанчана ДНК. Дакле, мерење количине апсорбоване светлости начин је за мерење колико се ваше дволанчане ДНК растопило у појединачне нити. Ефекат "магнетног затварача" парова база Г-Ц и А-Т је оно што узрокује да граф апсорпције светлости дволанчане ДНК исцртане против повећања температуре буде сигмоидан, у облику С, а не равне линије. Крива С представља отпор тимског рада који основни парови пружају против врућине јер се не желе раздвајати.
Тачка на пола пута
Температура на којој се дужина ДНК топи у једном ланцу назива се његовом температуром топљења, која је означена скраћеницом „Тм“. То означава температуру на којој се половина ДНК у раствору истопио у појединачне нити, а друга половина је још увек у двоструком облику. Температура топљења је различита за сваки фрагмент ДНК. Сисар ДНК има садржај Г-Ц од 40%, што значи да је преосталих 60% базних парова Ас и Тс. Његов 40% Г-Ц садржај узрокује да се ДНК сисара растопи на 87 степени Целзијуса (око 189 Фахренхеита). Зато је први корак ПЦР-а на ДНК сисара његово загревање на 94 степена Целзијуса (201 Фахренхеит). Само седам степени топлије од температуре топљења и сви двоструки нити ће се потпуно растопити у појединачне нити.