Садржај
- Шта је електрофореза гела?
- Компоненте електрофорезе
- Обликовање гела
- Како делује електрофореза?
- Набој и величина Одредити ДНК траке
- Примене и употребе електрофорезе
Гел електрофореза, која се често назива и електрофореза ДНК или једноставно електрофореза, је техника која се користи за одвајање фрагмената ДНК (и других набијених молекула) према величини. Ово се обично ради употребом агарозног гела и електричног набоја у циљу одвајања фрагмената један од другог.
Ова техника има неколико примена, укључујући испитивање ДНК, ДНК прстена, криминологију и разне медицинске примене.
Шта је електрофореза гела?
Гел електрофореза је техника која омогућава научницима да раздвоје набијене молекуле према величини. Ово укључује ДНК, РНК и протеине.
Запамтите, ДНК и РНА имају незнатан негативан набој захваљујући негативно наелектрисаним молекулима кисеоника у основи шећера-фосфата у молекули. Протеини могу да имају низ набоја у зависности од аминокиселина унутар полипептидног ланца.
Компоненте електрофорезе
Да би се извршила електрофореза прво је потребно направити гел. То се може урадити у готово свим лабораторијама; агарозни гелови су најчешћи. Да би се направио гел, агарозни прах се меша са посебним пуфером који се назива пуфер електрофорезе. Ова смеша се затим загрева док се агароза не растопи и потпуно помеша у пуфер раствор.
Имајте на уму да неки протоколи електрофорезе захтевају додавање етидијевог бромида (Ет-Бр). Ово мрља било коју ДНК која се користи у електрофорези како би вам омогућила да видите фрагменте под УВ светлошћу.
Обликовање гела
Затим се излива у правоугаони калуп који се зове кашика за ливење гела. Заједно са калупом који ствара правоугаони гел који се користи за електрофорезу, на један од крајева гела се поставља чешаљ. Овај чешаљ чини бушотине у које се учитавају узорци које желите да одвојите електрофорезом. Овде можете видети слику.
Након што се гел очврсне, чешаљ за јажицу се уклања и гел се ставља у посебан резервоар за електрофорезу. Још један пуфер се пуни у резервоар све док мали слој пуфера потпуно не покрије агарозни гел.
Овај резервоар производи електричну струју (у распону од 50 до 150 В) кроз пуфер, а заузврат, кроз агарозни гел. Бунари агарозног гела су смештени на негативном крају струје (тхе катода) са другим крајем гела на позитивном крају струје (тхе анода).
Како делује електрофореза?
Пре него што струјна струја прође кроз резервоар и гел, ваши узорци се стављају у бушотине. То се ради помоћу микропипете. Узорак „маркер“, такође познат као ДНК мердевина, је узорак познатих величина фрагмента ДНК који вам може помоћи да упоредите своје узорке и разумете величине узорка који тестирате.
Често а боја за праћење (такође се назива бојом за пуњење) додаје се сваком узорку како би вам помогао да убаците узорак у јажице. Боја вам такође помаже да пратите кретање узорака кроз гел.
Па како се узорци заправо крећу кроз гел и одвајају по величини? То има везе са електрична струја која пролази кроз агарозни гел заједно са величина / структура фрагмената и агарозни гел.
Набој и величина Одредити ДНК траке
Запамтите да је свеукупно наелектрисање ДНК негативан . Дакле, када се ти узорци положе у јажице које су близу негативног краја електричне струје, то ће узроковати померање негативно набијене ДНК далеко од катоде (негативно наелектрисање) и померајте се према аноди (позитивно наелектрисање) на супротном крају.
Поред овог кретања узорака, електрофореза такође раздваја узорке и фрагменте у тим узорцима по величини. То је зато мањи молекули и фрагменти могу кретати брже и лакше кроз гел већи молекули и фрагменти кретати се спорије. То значи да ће се мали фрагменти пребацити на крај гела брже од већих и, као резултат, сваки фрагмент одвоји по величини.
Након пуштања гела око сат времена (у већини протокола), пуњење се искључује и гел се анализира. Видећете различиту правоугаону траку, често називану ДНА траком или протеинском траком, на различитим тачкама гела. Свака трака представља један фрагмент који се померао дуж гела.
Примене и употребе електрофорезе
У лабораторији постоји много апликација за електрофорезу. Ево само неколико: