Садржај
- Ензими и рестриктивне странице за ограничење
- Права оријентација
- Лигирање лепљивих завршетака захтева мање ДНК
- Различити ензими могу дати исти љепљиви крај
Клонирање молекула је уобичајена биотехнолошка метода с којом би сваки студент и истраживач требао бити упознат. Молекуларно клонирање употребом врсте ензима названог рестрикционим ензимом за резање људске ДНК на фрагменте који се могу затим уметнути у плазмидну ДНК бактеријске ћелије. Рестриктивни ензими резали су дволанчане ДНК на пола. У зависности од рестрикцијског ензима, рез може резултирати или љепљивим или тупим крајем. Лепљиви крајеви су кориснији у молекуларном клонирању, јер осигуравају да се фрагмент људске ДНК убаци у плазмид у правом смеру. Процес лигације или спајање фрагмената ДНК захтева мање ДНК када ДНК има лепљиве крајеве. Коначно, вишеструки лепљиви крајњи ензими могу произвести исти лепљиви крај, иако сваки ензим препознаје различиту рестрикцијску секвенцу. То повећава вероватноћу да вашу ДНК регију која вас занима може исећи лепљиви крајњи ензими.
Ензими и рестриктивне странице за ограничење
Рестриктивни ензими су ензими који режу препознају специфичне секвенце на дволанчаној ДНК и пресечу ДНК на пола у том низу. Препозната секвенца назива се место рестрикције. Рестриктивни ензими називају се ендонуклеазе, јер они пресечу дволанчане ДНК, тако нормално ДНК постоји, на местима која су између крајева ДНК. Постоји више од 90 различитих рестрикцијских ензима. Свако препознаје различита места забране. Рестриктивни ензими цепају њихове рестриктивне локације 5000 пута ефикасније од осталих места која не препознају.
Права оријентација
Рестриктивни ензими долазе у две опште класе. Или су резали ДНК на лепљиве или тупе крајеве. Лепљиви крај има кратко подручје нуклеотида, градивних блокова ДНК, који није повезан. Ова неспарена регија назива се надстрешница. Каже се да је прекривач лепљив, јер жели да се удружи са другим лепљивим концем који има комплементарни низ прекривања. Лепљиви крајеви су попут давно изгубљених близанаца који желе да се чврсто загрле кад се сретну. С друге стране, тупи крајеви нису лепљиви јер су сви нуклеотиди већ упарени између два ланца ДНК. Предност лепљивих крајева је да фрагмент људске ДНК може да се уклопи у бактеријски плазмид само у једном правцу. Супротно томе, ако и хумана ДНК и бактеријски плазмид имају тупи крајеви, људска ДНК може се уметнути главе у реп или од главе до главе у плазмид.
Лигирање лепљивих завршетака захтева мање ДНК
Иако се ДНК са крајевима лепше проналази једни другима због своје „лепљивости“, ни лепљиви и неупадљиви крајеви не могу се стопити у континуирани део ДНК. За формирање непрекидног дела ДНК који је потпуно повезан потребан је ензим зван лигаза. Лигазе спајају окоснице нуклеотида на лепљивим или тупим крајевима, што резултира у континуираном ланцу нуклеотида. Пошто се лепљиви крајеви брже проналазе због привлачења један за другог, процес везивања захтева мање људске ДНК и мање плазмидне ДНК. Тупи крајеви ДНК и плазмиди су мање вероватни да се налазе, па стога лигација тупих крајева захтева да се више ДНК стави у епрувету.
Различити ензими могу дати исти љепљиви крај
Мјеста рестрикције налазе се на читавом геному организама, али нису равномјерно распоређена. У плазмидима се може конструисати тако да буду лоцирани један поред другог. Научници који желе да изсеку фрагмент људске ДНК из људског генома морају да пронађу места рестрикције која су испред и позади у односу на део фрагмента. Поред тога што осигуравају да се фрагмент ДНК уметне у правом смеру, различити лепљиви крајњи ензими могу створити исти лепљиви крај иако препознају различите рестрикцијске секвенце. На пример, БамХИ, БглИИ и Сау3А имају различите секвенце препознавања, али производе исти лепљиви крај ГАТЦ-а. То повећава вероватноћу да ће постојати лепљиви крајњи сајтови за ограничавање који ће употријебити ваш људски ген који вас занима.