Садржај
Када радите са течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ), добра калибрација је апсолутно неопходна за постизање поузданих и квалитетних резултата. Правилна калибрација ХПЛЦ инструмента започиње израдом одговарајућег стандарда за калибрацију. У већини случајева, калибрација у ствари захтева низ стандарда повећања концентрације да би се произвело оно што је познато као калибрациона крива. Ово је исцртана линија и придружена једначина која описује однос између концентрације хемикалије која се тестира и одговора ХПЛЦ детектора.
Одредите хемикалију коју желите да тестирате помоћу ХПЛЦ („аналит“). На пример, можда желите да тестирате серију безалкохолних пића на садржај фруктозе, у том случају фруктоза би била аналит.
Добија се количина хемикалије аналита одговарајуће чистоће. Чистоћа обично треба да буде већа од 99%, а аналит треба да буде купљен од угледне компаније за снабдевање хемикалијама. У случају фруктозе, на пример, чисту фруктозу бисте купили од продавца хемијских производа, а не из продавнице прехрамбених производа.
Одредите максималне и минималне очекиване концентрације аналита у узорцима које намеравате тестирати на ХПЛЦ. У случају безалкохолних пића, испитали бисте етикете пића и утврдили најнижи и највећи садржај фруктозе међу пићима која ћете тестирати. Имајте на уму да се почетни узорак (безалкохолно пиће) може разблажити или на други начин манипулисати током припреме за анализу (зависно од ХПЛЦ методе која се користи) и тако концентрација аналита у узорцима који се стварно убризгавају у ХПЛЦ може бити измењена. Концентрација аналита у узорцима која се одвија на ХПЛЦ мора се узети у обзир.
Одредите растварач у коме ћете растворити свој аналит да бисте поставили стандарде за калибрацију. Овај растварач мора бити у стању да правилно раствара аналит у релативно широком распону концентрација (бар толико високом као у узорцима које намеравате да тестирате). Такође, ово растварач би у идеалном случају требало да буде прилично слично "покретној фази:" растварачу који се користи за ношење узорака кроз ХПЛЦ инструмент.
Израчунајте количину аналита која је потребна да се направи „основни стандард“ решење аналита. Ово се проналази множењем потребне концентрације основног стандарда са жељеном запремином. Концентрација аналита у овом раствору треба да буде најмање 10% већа од највише очекиване концентрације узорка. Ако је највећа очекивана концентрација фруктозе у узорку безалкохолних пића 8 грама / 100 милилитара, тада би се основни стандард могао постићи до концентрације 10 грама фруктозе / 100 милилитара. Разумна запремина је 500 милилитара, тако да ће бити потребно 8/100 мЛ к 500 мЛ = 40 грама фруктозе.
Одмјерити потребну количину аналита до одговарајућег нивоа прецизности. Често је погодна вредност тежине у грамима прецизно до једне или две децималне тачке, али можда ће бити потребна већа прецизност за неке методе.
Премешајте одмерени аналит у волуметријску тиквицу потребне запремине и додајте жељени растварач у ознаку за пуњење у тиквици. Употреба волуметричне тиквице (на пример, уместо чаша са степеном) повећава прецизност стандардне вредности концентрације. Осигурати да се сав аналит пребаци у тиквицу; користите мало растварача да га оперете, ако је потребно.
Зауставите волуметријску тиквицу и лагано протресите или преокрените док се аналит потпуно не растопи.
Направите серију различитих разблаживања основног стандарда тако што ћете пребацити познате количине основног стандарда у волуметричне бочице, користећи пипете за тачан пренос, додајући растварач. Најнижа стандардна концентрација треба да буде испод најнижег очекиваног узорка који се анализира. У примеру безалкохолног пића, ако је најмања очекивана концентрација фруктозе у узорку 2 грама / 100 мЛ, тада се може направити стандард од 1 грам / 100 мЛ. То би се постигло десетоструким разблаживањем залиха. Стандардна серија треба да садржи укупно 5 или 6 концентрација, тако да ће бити потребна додатна разблажења да би се добили стандарди од можда 3, 5 и 8 грама фруктозе / мЛ. Сада имате низ стандардних решења помоћу којих можете калибрисати ХПЛЦ.