Садржај
Вестерн блотинг је један од најчешћих поступака у биохемијским лабораторијама. У основи, он одваја протеине од узорка по величини, а затим тестира помоћу антитела да би утврдио да ли је неки протеин присутан. Корисна је не само у истраживањима, већ иу медицинским или дијагностичким лабораторијама; тестови и за ХИВ и за лајмску болест, на пример, укључују испитивање имуносорбентом повезаног ензимом (ЕЛИСА) тест, а затим Вестерн блот ако је тест ЕЛИСА позитиван. Међутим, упркос популарности, Вестерн блотмент има неколико недостатака.
Неквалитативно
Класичне западне мрље нису квалитативне. Другим речима, иако могу да кажу истраживачима да ли је одређени протеин присутан, они не омогућавају да се утврди колика је количина протеина присутна. Неке биотехничке компаније сада продају сетове који истраживачима или лабораторијским техничарима омогућавају да квантификују количину протеина присутну помоћу стандардне криве - али то функционира само ако су доступни чисти узорци истог протеина. Поред тога, молекулска тежина протеина може се проценити само Вестерн блот-ом, уместо да се одреди прецизно као са масеном спектрометријом.
Антитела
Вестерн блот се може извести само ако су на располагању примарна антитела против протеина који вас занима. Иако су антитела за много различитих протеина доступна од биотехничких компанија, она нису јефтина; ако примарна антитела нису доступна за одређени протеин, неће бити могуће извршити Вестерн блот у потрази за тим одређеним протеином. Штавише, истраживачи ће можда желети да утврде да ли је протеин на неки начин модификован - на пример, ако је био фосфорилиран (ако је на њега била прикључена фосфатна група) - и техником Вестерн блот потребна су антитела специфична за модификоване беланчевина.
обука
Исправно извести вестерн и имати добре резултате може бити изазовно, па особље мора бити добро обучено.И у овоме, као иу многим другим, искуство је можда најбољи учитељ; Међутим, чак и за искусног техничара, Вестерн блотту је потребно много времена. На пример, део експеримента са гел електрофорезом обично траје од једног до два сата. Остали задаци се могу обављати током гела, наравно, али експерименту је потребно доста времена да бисте добили резултате.
Остала ограничења
Антитела могу понекад да показују неко ван-циљано везивање, што може довести до лоших резултата. Штавише, уз Вестерн блот, користите антитело против одређеног протеина, тако да ће вам резултати рећи само ако је тај протеин присутан. Масна спектрометрија високе резолуције, насупрот томе, открива све протеине присутне у узорку, а за разлику од класичног вестерн-блотмента, она је квантитативна. Важно је, наравно, имати на уму да је масна спектрометрија много скупља, а такође и технички захтевнија за употребу у поређењу са Вестерн блоттингом.