Садржај
Квантитативно одредите свој РНА узорак мерењем његове апсорпције ултраљубичастог светла (УВ). Нано-кап спектрофотометар користиће само један или два микролитара вашег узорка, који можете да вратите. Остали спектрофотометри захтевају много већи узорак. Коефицијент изумирања нуклеотида на УВ таласној дужини од 260 нм при светлосном путу од 1 цм износи 20. На основу овог коефицијента екстинкције апсорбанција 40 µг / мл РНА под истим условима је једна. Користећи ове информације, можете израчунати концентрацију свог РНА узорка.
Направите разблаживање, ако је потребно, свог узорка. Стандардно разређивање микрокувете је 1:40. Направите ово разблажење додавањем 2 уЛ узорка РНК у стерилну воду 78 ул.
Следите протоколе вашег одређеног спектрофотометра да бисте калибрирали машину коришћењем празног узорка, а затим одредите оптичку густину вашег узорка на УВ таласној дужини од 260 нм.
Помножите апсорпцију вашег узорка са фактором разблажења за 40 μг РНА / мЛ. Једнаџба би била: „Концентрација РНА (µг / мл) = (ОД260) к (фактор разблажења) к (40 µг РНА / мл) / (1 јединица ОД260)“ (Хофстра.еду) На пример: Ако сте узорак разблажили са 1:40, а очитавање апсорбанције било је 0,08, помножили бисте 0,08 к 40 к 40 = 128 µг / мл = 0,13 µг / µЛ
Израчунајте чистоћу свог узорка тако што ћете узети друго очитавање апсорбанције на таласној дужини од 280 нм. Однос ОД 260 / ОД 280 указује да ли је - и на ком нивоу - ваш узорак контаминиран протеинима или фенолом. Резултат од 1,8 до 2,0 указује на квалитетну РНК.